กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล กล้องจุลทรรศน์ Confocal Intravital ของกระจกตา กล้องจุลทรรศน์ Confocal Fluorescence

กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงหรือฟลูออเรสเซนต์- วิธีการวิเคราะห์ทางจุลพยาธิวิทยาโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ซึ่งใช้ปรากฏการณ์การเรืองแสง (glow) ของสารเมื่อสัมผัสกับรังสีคลื่นสั้น (แสงอัลตราไวโอเลต, รังสีเอกซ์) สารประกอบทางชีวภาพบางชนิดที่มีอยู่ในเซลล์มีลักษณะเฉพาะด้วยการเรืองแสงได้เองเมื่อรังสีอัลตราไวโอเลตกระทบเซลล์ เพื่อตรวจจับสารประกอบอื่นๆ ส่วนใหญ่ เซลล์จะได้รับการบำบัดด้วยฟลูออโรโครมพิเศษ (ฟลูออเรสซีน, ส้มอะคริดีน, คอรีฟอสฟีน) ฟลูออโรโครมใช้ในการศึกษา เช่น ปริมาณกรดนิวคลีอิกในเซลล์ เมื่อย้อมด้วยอะคริดีน DNA จะให้แสงสีแดงเขียว และ RNA จะเป็นสีส้ม

กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงนอกจากนี้ยังใช้กันอย่างแพร่หลายในการศึกษาอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ช่วยให้สามารถตรวจสอบปริมาณโปรตีนในเซลล์จำนวนน้อยมาก ยานี้ได้รับการบำบัดล่วงหน้าด้วยแอนติบอดีต่อโปรตีนที่อยู่ระหว่างการศึกษาซึ่งมีป้ายกำกับด้วยสีย้อมเรืองแสง

กล้องจุลทรรศน์อัลตราไวโอเลต- วิธีการศึกษาเซลล์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ที่ใช้รังสีอัลตราไวโอเลต (ความยาวคลื่น 210-275 นาโนเมตร) ในการส่องสว่างวัตถุ กล้องจุลทรรศน์ดังกล่าวมีความละเอียดมากกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั่วไป ในการสังเกตวัตถุจำเป็นต้องมีอุปกรณ์พิเศษ - ตัวแปลงอิเล็กตรอน - ออปติคอลซึ่งช่วยปกป้องอวัยวะที่มองเห็นจากการกระทำของรังสีอัลตราไวโอเลต

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน. กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนใช้ลำแสงอิเล็กตรอนที่มีความยาวคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้าสั้นกว่าความยาวคลื่นของแสงที่ตามองเห็นถึง 100,000 เท่า ความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนนั้นสูงกว่าอุปกรณ์เชิงแสงทั่วไปหลายร้อยพันเท่าและเท่ากับ 0.5-1 นาโนเมตร และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบเมกะโวลต์สมัยใหม่ให้ความละเอียดเพิ่มขึ้นถึง 1,000,000 เท่า การใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน ทำให้ได้รับข้อมูลจำนวนมากเกี่ยวกับโครงสร้างพิเศษของเซลล์ กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนชนิดหนึ่งคือกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (SEM) ซึ่งศึกษาโครงสร้างพื้นผิวของเซลล์

ไซโตสเปกโตรโฟโตมิเตอร์- วิธีการศึกษาองค์ประกอบทางเคมีของเซลล์โดยอาศัยการดูดกลืนแสงแบบเลือกสรรของรังสีที่มีความยาวคลื่นที่แน่นอนโดยสารบางชนิด ขึ้นอยู่กับความเข้มของการดูดกลืนแสงซึ่งขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของสารเนื้อหาในเซลล์จะถูกกำหนดในเชิงปริมาณ

การถ่ายภาพอัตโนมัติ- วิธีการให้ข้อมูลที่สำคัญที่ช่วยให้คุณศึกษาการกระจายตัวในเซลล์และเนื้อเยื่อของสารที่มีการนำไอโซโทปกัมมันตภาพรังสีมาใช้ (3H, HC, 32P เป็นต้น) ไอโซโทปที่ใส่เข้าไปในร่างกายของสัตว์ (หรือในอาหารเลี้ยงเซลล์) จะรวมอยู่ในโครงสร้างที่เกี่ยวข้อง (เช่น ที่ระบุว่าไทมิดีน - ในนิวเคลียสของเซลล์ที่สังเคราะห์ DNA) วิธีการนี้ขึ้นอยู่กับความสามารถของไอโซโทปที่อยู่ในเซลล์ในการลดซิลเวอร์โบรไมด์ในอิมัลชันการถ่ายภาพที่เคลือบส่วนเนื้อเยื่อหรือเซลล์ เม็ดเงิน (ราง) ที่เกิดขึ้นหลังจากการพัฒนาอิมัลชันการถ่ายภาพทำหน้าที่เป็นลายเซ็นชนิดหนึ่งซึ่งมีการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นเพื่อตัดสินการรวมสารที่ใช้ในเซลล์ การใช้สารตั้งต้นของกรดนิวคลีอิกที่มีฉลากไอโซโทป (ไทมิดีน อะดีนีน ไซติดีน ยูริดีน) ทำให้สามารถอธิบายแง่มุมที่สำคัญหลายประการของการสังเคราะห์ DNA, RNA และโปรตีนในเซลล์ได้

วิธีฮิสโตและอิมมูโนไซโตเคมีคอล. ขึ้นอยู่กับการใช้ปฏิกิริยาเคมีเพื่อระบุการกระจายตัวของสารเคมีในโครงสร้างเซลล์ เนื้อเยื่อ และอวัยวะ วิธีการฮิสโตเคมีสมัยใหม่ทำให้สามารถตรวจจับกรดอะมิโน โปรตีน กรดนิวคลีอิก คาร์โบไฮเดรตประเภทต่างๆ ไขมัน ฯลฯ ได้ ปฏิกิริยาอิมมูโนไซโตเคมีถูกนำมาใช้เพื่อระบุโปรตีนจำเพาะ ในการทำเช่นนี้จะได้รับซีรั่มที่มีแอนติบอดีจำเพาะ (ตัวอย่างเช่นกับโปรตีน microtubule - tubulin) ต่อไป แอนติบอดีเหล่านี้จะถูกรวมเข้าด้วยกันทางเคมีกับฟลูออโรโครม (หรือเครื่องหมายอื่นๆ) ถ้าแอนติบอดีที่มีป้ายกำกับถูกนำไปใช้กับส่วนเนื้อเยื่อวิทยา แอนติบอดีเหล่านั้นจะรวมกับโปรตีนของเซลล์ที่เกี่ยวข้องและเรืองแสงเฉพาะจะปรากฏขึ้น ซึ่งมองเห็นได้ในกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ วิธีอิมมูโนไซโตเคมีคอลสมัยใหม่ นอกเหนือจากฟลูออโรโครมแล้ว ยังใช้เครื่องหมายเฉพาะอื่นๆ ที่หลากหลาย ซึ่งช่วยให้สามารถประเมินเนื้อหาของสารประกอบที่ศึกษาในเซลล์ได้ทั้งเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณ การปรับเปลี่ยนวิธีการที่กำลังพิจารณาคือการแนะนำแอนติบอดีที่มีฉลากเข้าไปในไซโตพลาสซึมของเซลล์ที่มีชีวิตโดยใช้ไมโครมานิปูเลเตอร์

วิธีการเพาะเลี้ยงเซลล์เนื้อเยื่อประกอบด้วยเซลล์ที่กำลังเติบโตและเนื้อเยื่อภายนอกร่างกายในสื่อสารอาหารเทียม (สภาวะในหลอดทดลอง) เพื่อให้ได้เซลล์ที่แยกได้ วัสดุจะถูกเตรียมด้วยเอนไซม์ทริปซินหรือคอลลาเจนเนส วิธีการนี้ทำให้สามารถศึกษาการตอบสนองของเซลล์ต่ออิทธิพลต่างๆ กลไกการควบคุมการเพิ่มจำนวน การสร้างความแตกต่าง และความตาย วิธีนี้มีความสำคัญอย่างยิ่งสำหรับการศึกษาเกี่ยวกับตัวอ่อนและเซลล์สรีรวิทยา เช่นเดียวกับการปลูกถ่ายเซลล์ตัวอ่อนในการรักษาความบกพร่องทางเมตาบอลิซึมที่มีมา แต่กำเนิดและที่ได้มา

การผ่าตัดเซลล์ด้วยกล้องจุลทรรศน์- ชุดเทคนิคระเบียบวิธีดำเนินการโดยใช้อุปกรณ์พิเศษ - ไมโครมานิปูเลเตอร์ อุปกรณ์นี้ทำให้สามารถดำเนินการที่ละเอียดอ่อนได้หลายประเภทในเซลล์ (การแนะนำสาร การถอดหรือย้ายส่วนประกอบโครงสร้างของเซลล์ การฉีดยา การกรีด ฯลฯ) และพบว่ามีการนำไปใช้อย่างกว้างขวางในด้านคัพภวิทยา

ไทม์แลปส์หรือสโลว์โมชั่น, ไมโครซีน หรือ การถ่ายทำวิดีโอ - การศึกษาเซลล์ของสิ่งมีชีวิต วิธีนี้ช่วยให้คุณติดตามการเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้นอย่างช้าๆ ในเซลล์ได้

วิธีการแยกส่วน(การหมุนเหวี่ยงแบบดิฟเฟอเรนเชียล) ของเซลล์ สาระสำคัญอยู่ที่การได้รับส่วนประกอบโครงสร้างที่แยกได้จากเซลล์ ขึ้นอยู่กับอัตราการตกตะกอนที่แตกต่างกันของส่วนประกอบเหล่านี้ในระหว่างการหมุนของเซลล์ที่เป็นเนื้อเดียวกันในเครื่องหมุนเหวี่ยงแบบอัลตราโซนิก วิธีการนี้ได้เล่นและยังคงมีบทบาทสำคัญมากในการศึกษาองค์ประกอบทางเคมีและคุณสมบัติเชิงหน้าที่ขององค์ประกอบย่อยเซลล์ - ส่วนใหญ่เป็นออร์แกเนลล์

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล- วิธีการสมัยใหม่ที่ใช้ลำแสงเลเซอร์เป็นตัวส่องสว่าง ซึ่งจะสแกนความหนาทั้งหมดของตัวยาตามลำดับ ข้อมูลเกี่ยวกับความหนาแน่นของวัตถุตามเส้นสแกนแต่ละเส้นจะถูกส่งไปยังคอมพิวเตอร์ โดยที่โปรแกรมพิเศษจะดำเนินการสร้างวัตถุสามมิติขึ้นมาใหม่ภายใต้การศึกษา

กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงยังได้รับการพัฒนาอย่างเข้มข้นโดยใช้ความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีสารสนเทศและเทคโนโลยีคอมพิวเตอร์ล่าสุด สิ่งนี้นำไปสู่การปรับปรุงอุปกรณ์ที่มีอยู่และวิธีการใช้งาน ซึ่งนำไปสู่การเกิดขึ้นของวิธีการใหม่ โดยเฉพาะอย่างยิ่งกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแตกต่างจากอุปกรณ์ออพติคอล "คลาสสิก" ตรงที่ในแต่ละช่วงเวลาจะมีการบันทึกภาพของจุดหนึ่งของวัตถุ และสร้างภาพเต็มโดยการสแกน (ย้ายตัวอย่างหรือจัดเรียงระบบออพติคอลใหม่) ดังนั้นหลักการของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราดจึงถูกนำมาใช้ในรูปแบบเฉพาะซึ่งทำให้สามารถบันทึกและประมวลผลสัญญาณจากแต่ละจุดได้นานเท่าที่ต้องการ

ในกล้องจุลทรรศน์แบบธรรมดา แสงจะเข้าสู่โฟโตตรวจจับพร้อมๆ กันจากจุดต่างๆ ของตัวอย่าง ในกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล เพื่อที่จะบันทึกแสงจากจุดเดียว ไดอะแฟรมขนาดเล็กจะตั้งอยู่หลังเลนส์ใกล้วัตถุในลักษณะที่แสงที่ปล่อยออกมาจากจุดที่วิเคราะห์จะผ่านไดอะแฟรมและถูกบันทึก และแสงจากจุดอื่นๆ ถูกหน่วงโดยไดอะแฟรม ดังแสดงในรูป 15.31.

ข้าว. 15.31

คุณสมบัติอีกประการหนึ่งคือตัวส่องสว่างไม่ได้สร้างแสงสว่างที่สม่ำเสมอในขอบเขตการมองเห็น แต่จะเน้นแสงในบริเวณใกล้เคียงกับจุดที่วิเคราะห์ ซึ่งสามารถทำได้โดยการวางระบบโฟกัสที่สองไว้ด้านหลังตัวอย่าง แต่ตัวอย่างจะต้องโปร่งใส นอกจากนี้ เลนส์ใกล้วัตถุมักจะมีราคาแพง ดังนั้นการใช้ระบบโฟกัสที่สองเพื่อให้แสงสว่างจึงอาจไม่สมเหตุสมผลเสมอไป อีกทางเลือกหนึ่งคือการใช้ตัวแยกลำแสงเพื่อให้ทั้งแสงตกกระทบและแสงสะท้อนถูกโฟกัสด้วยเลนส์เพียงตัวเดียว โครงการนี้ยังทำให้การปรับเปลี่ยนง่ายขึ้น

ตอนนี้ให้เราพิจารณาแบบจำลองทางคณิตศาสตร์สำหรับการประเมินการเปลี่ยนแปลงเชิงปริมาณในทางตรงกันข้ามเมื่อใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล เนื่องจากแสงส่องผ่านเลนส์สองครั้งในกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล ฟังก์ชั่นจุดเบลอจึงเป็นผลคูณของความน่าจะเป็นอิสระที่โฟตอนจะชนจุดตามพิกัดของมัน และโฟตอนที่ออกจากจุดนั้นจะถูกตรวจพบ

ตามเกณฑ์การแก้ปัญหาของ Rayleigh ปรากฎว่าความละเอียดในกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเพิ่มขึ้น แต่ไม่มีนัยสำคัญ สำหรับกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล เรามีการแสดงออกถึงความละเอียด ช

ในขณะที่กล้องจุลทรรศน์ธรรมดา

โดยที่ ก." = สูง/ไม่มี; ป- ดัชนีการหักเหของแสง 0 - มุมรูรับแสง; ดี- เส้นผ่านศูนย์กลางรูรับแสง ฉ-ความยาวโฟกัส.

ข้อได้เปรียบหลักของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลไม่ใช่การเพิ่มความละเอียด (ในแง่ของเกณฑ์ของเรย์ลี) แต่เป็นการเพิ่มความคมชัดอย่างมีนัยสำคัญ วัตถุสลัวที่มีความเข้ม เช่น น้อยกว่าวัตถุสว่าง 200 เท่า จะไม่สามารถมองเห็นได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์ธรรมดา แม้ว่าระยะห่างระหว่างวัตถุอาจมากกว่าที่กำหนดโดยเกณฑ์ของเรย์ลีมากก็ตาม ในทางตรงกันข้าม กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลควรบันทึกวัตถุดังกล่าว

พารามิเตอร์ที่สำคัญคือขนาดของรูรับแสงในระนาบโฟกัสของเลนส์ที่ฉายรังสีและสะสม ภาพของไดอะแฟรมในระนาบวัตถุจะกำหนดแสงจากพื้นที่ที่เครื่องตรวจจับแสงจะบันทึก อย่างไรก็ตาม เป็นที่ชัดเจนว่าการลดขนาดรูรับแสงจะลดปริมาณแสงที่ส่องผ่าน ลดอัตราส่วนสัญญาณต่อเสียงรบกวน และท้ายที่สุดก็สามารถลบล้างผลประโยชน์ด้านคอนทราสต์ใดๆ ที่ได้รับได้ ดังนั้น คำถามจึงเกิดขึ้นเกี่ยวกับการเลือกขนาดรูรับแสงที่เหมาะสมที่สุดและการประนีประนอมที่สมเหตุสมผล

รูรับแสงที่มีช่องเปิดเล็กกว่าจุด Airy ส่งผลให้สูญเสียความเข้มและไม่มีผลกระทบต่อความละเอียด ขนาดรูรับแสงของจุด Airy หนึ่งจุดช่วยให้ใช้กำลังการแยกรายละเอียดของเลนส์ใกล้วัตถุได้สูงสุด แต่ขนาดรูรับแสงที่ใหญ่กว่าจุดโปร่งประมาณ 3-5 เท่าดูเหมือนจะเหมาะสมที่สุด ควรเข้าใจว่าขนาดที่กล่าวถึงในที่นี้หมายถึงขนาดของภาพในระนาบวัตถุ ดังนั้น ขนาดที่แท้จริงของรูรูรับแสงจึงขึ้นอยู่กับกำลังขยายของเลนส์ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เมื่อใช้เลนส์ 100x รูรับแสงที่มีรูรับแสง 1 มม. จะฉายเข้าไปในระนาบวัตถุเป็นวงกลมรัศมี 10 µm

การพัฒนาแนวคิดของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลคือการพัฒนา กล้องจุลทรรศน์สแกนด้วยเลเซอร์คอนโฟคอล(CLSM) ซึ่งมีสาเหตุมาจากความต้องการวิธีวิเคราะห์รูปร่างและโครงสร้างเชิงพื้นที่ของวัตถุที่สังเกตได้ที่มีความละเอียดอ่อนและเข้มงวดมากขึ้น แผนภาพ CLSM พร้อมการเชื่อมต่อการทำงานหลักจะแสดงในรูปที่ 1 15.32.

ข้าว. 15.32.1 - ตารางพิกัด 2- ตัวอย่างทดสอบ

3,6 - เลนส์; 4 - อุปกรณ์สแกน 5 - ตัวแยกลำแสง; 7, 9- ไดอะแฟรมเข็ม 8- เครื่องรับรังสี 10 - เลเซอร์ 11 - บล็อกควบคุม 12 - คอมพิวเตอร์; 13 - ขับเคลื่อนการสแกนตามแนวแกน ซี

ลักษณะเฉพาะของ CLSM คือความเป็นไปได้ของการถ่ายภาพวัตถุที่อยู่ระหว่างการศึกษาแบบชั้นต่อชั้นด้วยความละเอียดสูงและระดับสัญญาณรบกวนต่ำ ซึ่งทำได้โดยการสแกนวัตถุทีละขั้นตอนด้วยลำแสงโฟกัสจากแหล่งกำเนิดที่สอดคล้องกัน หรือใช้สเตจที่มีโพรบฟลูออเรสเซนต์แบบพิเศษ รวมถึงวิธีการพิเศษในการจำกัดฟลักซ์แสง

ความละเอียดของ CLSM ถูกกำหนดโดยทั้งระบบออปติคัลและเส้นทางการประมวลผลข้อมูลอิเล็กทรอนิกส์ ดังนั้นในการออกแบบ CLSM และวงจร พารามิเตอร์ต่างๆ เช่น ความละเอียดของระบบออปติคัล ขั้นตอนการสแกน คุณลักษณะของเครื่องตรวจจับจะต้องได้รับการประสานกัน นอกจากนี้ จะต้องเลือกอัลกอริธึมการประมวลผลที่เหมาะสมที่สุดและซอฟต์แวร์ที่เหมาะสม

โดยทั่วไป ระยะชัดลึกของ CLSM ขึ้นอยู่กับรูรับแสง ความยาวคลื่น ความสอดคล้องกันของแหล่งกำเนิดแสง และขนาดของไดอะแฟรมแบบเข็ม ไดอะแฟรมเข็ม(ID) เป็นองค์ประกอบการออกแบบหลักที่ทำให้ CLSM แตกต่างจากกล้องจุลทรรศน์ประเภทอื่นๆ ไดอะแฟรมแบบเข็มได้รับการออกแบบเพื่อสร้างเงื่อนไขสำหรับการกรองแสงสูงสุดหรือสมบูรณ์ที่เข้าสู่ระนาบการก่อตัวของภาพจากจุดที่ไม่ตรงกับระนาบโฟกัสหรืออยู่ติดกับองค์ประกอบที่วิเคราะห์ของวัตถุในระนาบโฟกัส

การเลือกเส้นผ่านศูนย์กลาง ID ที่เหมาะสมเป็นสิ่งสำคัญเพื่อให้ได้คุณลักษณะของอุปกรณ์ที่ต้องการ ความสัมพันธ์ในการประมาณค่าความละเอียดด้านข้างและระยะชัดลึกของ CLSM ได้มาจากสมมติฐานที่ว่า ID มีรูรับแสงแคบและเป็นจุดส่องสว่าง ในความเป็นจริง ขนาดของ ID นั้นมีจำกัด และความละเอียดด้านข้างของอุปกรณ์ ความสว่างขององค์ประกอบที่ส่องสว่างของการเตรียมการจะเลื่อนสัมพันธ์กับระนาบโฟกัสตามแนวแกน Z และความชัดลึกขึ้นอยู่กับมัน

ด้วยเส้นผ่านศูนย์กลาง ID ขนาดเล็ก ฟลักซ์การส่องสว่างจะต่ำ ซึ่งจะลดอัตราส่วนสัญญาณต่อเสียงรบกวนและลดคอนทราสต์ ด้วยเส้นผ่านศูนย์กลางขนาดใหญ่ ประสิทธิภาพของไดอะแฟรมจะลดลงโดยการลดขนาดรูรับแสง

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล- หนึ่งในวิธีการวิจัยสมัยใหม่ ช่วยให้สามารถติดตามสภาพของกระจกตาในช่องปากด้วยการแสดงภาพเนื้อเยื่อในระดับเซลล์และโครงสร้างจุลภาค

เนื่องจากการออกแบบกล้องจุลทรรศน์แบบดั้งเดิมและมีความละเอียดสูง วิธีการนี้ทำให้สามารถมองเห็นเนื้อเยื่อที่มีชีวิตของกระจกตา วัดความหนาของแต่ละชั้น และประเมินระดับของความผิดปกติทางสัณฐานวิทยาได้ด้วย

เพื่อระบุลักษณะการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของกระจกตาที่เกิดขึ้นระหว่างโรคอักเสบและโรค dystrophic ต่างๆ รวมถึงเนื่องจากการผ่าตัดและการสัมผัสกับ CL

ข้อมูลการตรวจทางสัณฐานวิทยาจำเป็นต่อการประเมินความรุนแรงของกระบวนการทางพยาธิวิทยา ประสิทธิผลของการรักษา และกำหนดกลยุทธ์ในการจัดการผู้ป่วย

ข้อบ่งชี้

โรคอักเสบของกระจกตา (keratitis)
โรค Dystrophic ของกระจกตา (keratoconus, dystrophy ของ Fuchs ฯลฯ )
โรคตาแห้ง
เงื่อนไขหลังการผ่าตัดกระจกตา (ผ่านการปลูกถ่ายกระจกตา, การผ่าตัดแก้ไขสายตาผิดปกติ)
เงื่อนไขที่เกี่ยวข้องกับการสวมใส่ CL

ข้อห้าม

ข้อห้ามสัมพัทธ์คือการระคายเคืองตาอย่างรุนแรงกับพื้นหลังของกระบวนการอักเสบเฉียบพลัน

การตระเตรียม

การดำเนินการศึกษาครั้งนี้เป็นไปได้โดยไม่ต้องใช้ยาชา หยดของเหลวแช่ไว้บนเลนส์ใกล้วัตถุของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล ซึ่งช่วยลดการสัมผัสเลนส์กับกระจกตาโดยตรง และลดความเสี่ยงของความเสียหายของเยื่อบุผิว

ระเบียบวิธี

การศึกษานี้ดำเนินการด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล ConfoScan 4 (Nider) ที่มีกำลังขยาย 500 เท่า อุปกรณ์นี้ช่วยให้คุณตรวจกระจกตาได้ตลอดความหนาทั้งหมด

ขนาดของพื้นที่ภายใต้การศึกษาคือ 440x330 µm ความหนาของชั้นการสแกนคือ 5 µm เลนส์ที่มีเจลหยดหนึ่งจะถูกนำไปที่กระจกตาจนกระทั่งสัมผัสและติดตั้งเช่นนี้ เพื่อให้ความหนาของชั้นของเหลวแช่อยู่ที่ 2 มม. การออกแบบอุปกรณ์ช่วยให้คุณตรวจสอบกระจกตาในโซนกลางและส่วนพาราเซนทรัลได้ (รูปที่ 7-1; รูปที่ 7-2.)

การตีความ

ภาพทางสัณฐานวิทยาปกติของกระจกตา

เยื่อบุผิวด้านหน้าประกอบด้วยเซลล์ 5-6 ชั้น ความหนาเฉลี่ยของเยื่อบุทั้งหมดคือประมาณ 50 µm ตามโครงสร้างทางสัณฐานวิทยาชั้นต่อไปนี้มีความโดดเด่น (จากภายในสู่ภายนอก): ซ้ำ ๆ เซลล์สไตลอยด์และผิวเผิน

ชั้นในสุด (ฐาน) ประกอบด้วยเซลล์ทรงกระบอกขนาดเล็กหนาแน่น โดยไม่มีนิวเคลียสที่มองเห็นได้ ขอบเขตของเซลล์ฐานมีความชัดเจนและสว่าง (รูปที่ 7-3)

ชั้นกลางประกอบด้วยเซลล์ spinous (มีปีก) 2-3 ชั้นที่มีการบุกรุกลึกลงไปซึ่งผลพลอยได้ของเซลล์ข้างเคียงจะถูกฝังอยู่ ด้วยกล้องจุลทรรศน์ ขอบเขตของเซลล์ค่อนข้างมองเห็นได้ชัดเจน แต่นิวเคลียสอาจไม่สามารถระบุได้หรืออาจไม่ชัดเจน (รูปที่ 7-4)

ชั้นผิวของเยื่อบุผิวนั้นแสดงด้วยเซลล์เหลี่ยมหนึ่งหรือสองชั้นที่มีขอบเขตชัดเจนและความหนาแน่นเป็นเนื้อเดียวกัน นิวเคลียสมักจะสว่างกว่าไซโตพลาสซึม ซึ่งสามารถมองเห็นวงแหวนสีเข้มของนิวเคลียสได้ (รูปที่ 7-5)

ในบรรดาเซลล์ของชั้นผิวนั้นมีความแตกต่างระหว่างความมืดและความสว่าง การสะท้อนกลับที่เพิ่มขึ้นของเซลล์เยื่อบุผิวบ่งชี้ว่าระดับการเผาผลาญและการทำลายล้างเริ่มต้นลดลง

เยื่อหุ้มเซลล์ของโบว์แมนเป็นโครงสร้างโปร่งใสที่ไม่สะท้อนแสง ดังนั้นปกติแล้วการมองเห็นของมันจึงไม่สามารถทำได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล

ช่องท้องเส้นประสาทใต้ฐานอยู่ใต้เยื่อหุ้มสมองของโบว์แมน โดยปกติแล้ว เส้นใยประสาทจะมีลักษณะเป็นแถบสีสว่างทอดขนานกับพื้นหลังสีเข้มและติดต่อกัน การสะท้อนกลับ (reflectivity) อาจไม่เท่ากันตามความยาวของเส้นใย (รูปที่ 7-6)

กระจกตาสโตรมาครอบครองความหนาของกระจกตา 80 ถึง 90% และประกอบด้วยส่วนประกอบของเซลล์และนอกเซลล์ องค์ประกอบเซลล์หลักของสโตรมาคือ keratocytes; คิดเป็นประมาณ 5% ของปริมาตร

ลักษณะทั่วไปของสโตรมาด้วยกล้องจุลทรรศน์ประกอบด้วยวัตถุรูปไข่ที่สว่างและไม่สม่ำเสมอหลายอัน (นิวเคลียสของเคราโตไซต์) ซึ่งอยู่ภายในเมทริกซ์สีเทาเข้มหรือสีดำโปร่งใส โดยปกติแล้ว การแสดงโครงสร้างภายนอกเซลล์เป็นไปไม่ได้เนื่องจากความโปร่งใส สโตรมาสามารถแบ่งออกเป็นชั้นย่อยตามเงื่อนไข: ด้านหน้า (อยู่ใต้เมมเบรนของโบว์แมนโดยตรงและคิดเป็น 10% ของความหนาของสโตรมา), ส่วนหน้า, ตรงกลางและด้านหลัง

ความหนาแน่นเฉลี่ยของ keratocytes จะสูงกว่าในสโตรมาด้านหน้า โดยจำนวนจะค่อยๆ ลดลงไปทางชั้นหลัง ความหนาแน่นของเซลล์ในสโตรมาด้านหน้านั้นสูงเกือบสองเท่าของความหนาแน่นของเซลล์ในสโตรมาด้านหลัง (หากความหนาแน่นของเซลล์ในสโตรมาด้านหน้าถูกนำไปเป็น 100% ความหนาแน่นของเซลล์ในสโตรมาด้านหลังจะอยู่ที่ประมาณ 53.7%) ในสโตรมาด้านหน้านิวเคลียสของ keratocyte จะมีรูปร่างกลมรูปถั่วและในสโตรมาด้านหลังจะเป็นรูปไข่และยาวกว่า (รูปที่ 7-7.7-8)

นิวเคลียสของเคราโตไซต์อาจแตกต่างกันไปตามความสว่าง ความสามารถในการสะท้อนแสงที่แตกต่างกันขึ้นอยู่กับสถานะการเผาผลาญ เซลล์ที่สว่างกว่านั้นถือเป็นเซลล์เคราโตไซต์ (“เซลล์ความเครียด”) ที่ถูกกระตุ้นซึ่งมีกิจกรรมมุ่งเป้าไปที่การรักษาสภาวะสมดุลภายในของกระจกตา ในสภาวะปกติและในขอบเขตการมองเห็นจะพบเซลล์ที่เปิดใช้งานเดี่ยว (รูปที่ 7-9)

เส้นใยประสาทในสโตรมาด้านหน้าของกระจกตาจะถูกมองเห็นในรูปแบบของแถบเนื้อเดียวกันที่สดใสซึ่งมักจะก่อตัวเป็นแฉก (รูปที่ 7-10)

เยื่อหุ้มของ Descemetปกติจะโปร่งใสและไม่สามารถมองเห็นได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล

เยื่อบุผิวด้านหลังเป็นชั้นเดียวของเซลล์แบนหกเหลี่ยมหรือหลายเหลี่ยมที่มีพื้นผิวที่สว่างสม่ำเสมอบนพื้นหลังของขอบเขตระหว่างเซลล์สีเข้มที่ชัดเจน (รูปที่ 7-11)

อุปกรณ์นี้มีความสามารถในการคำนวณความหนาแน่นของเซลล์ พื้นที่ของเซลล์ และค่าสัมประสิทธิ์ความแปรปรวนด้วยตนเองหรือโดยอัตโนมัติ

การเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาในโครงสร้างของกระจกตา

Keratoconus มีลักษณะเฉพาะโดยการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในเยื่อบุผิวด้านหน้าและสโตรมาของกระจกตา

เยื่อบุผิวด้านหน้า ตรวจพบเยื่อบุผิวหลายประเภท (รูปที่ 7-12)

ความก้าวหน้าทางพันธุวิศวกรรม โปรตีโอมิกส์ เทคโนโลยีชีวภาพ เภสัชกรรมสมัยใหม่ และชีวการแพทย์ ได้อำนวยความสะดวกในการแนะนำเทคนิคการใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลใหม่ๆ อย่างรวดเร็ว และปัจจุบันมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในชีววิทยาของเซลล์

กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบคอนโฟคอลถือได้ว่าเป็นกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบดั้งเดิมชนิดหนึ่ง ซึ่งช่วยให้สามารถศึกษาโครงสร้างจุลภาคภายในของเซลล์ ไม่เพียงแต่แบบตายตัวเท่านั้น แต่ยังรวมถึงสิ่งมีชีวิตด้วย ระบุจุลินทรีย์ โครงสร้างเซลล์ และโมเลกุลแต่ละตัว และสังเกตกระบวนการไดนามิกในเซลล์ . นอกจากนี้ กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์คอนโฟคอลยังให้ความเป็นไปได้ในความละเอียดระดับซับไมครอนสามมิติของวัตถุ และขยายความเป็นไปได้ของการวิเคราะห์ตัวอย่างโปร่งใสโดยไม่ทำลายอย่างมีนัยสำคัญ ความละเอียดที่เพิ่มขึ้นทำได้โดยการใช้เลเซอร์ในกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเป็นแหล่งกำเนิดแสงและไดอะแฟรมคอนโฟคอลเพื่อกรองแสงเรืองแสงที่อยู่นอกโฟกัส ข้อดีของเลเซอร์เหนือหลอดปรอทหรือซีนอนคือลำแสงที่ปล่อยออกมามีสีเดียวและมีความขนานสูง คุณสมบัติของการแผ่รังสีเลเซอร์เหล่านี้ช่วยให้ระบบออพติคอลของกล้องจุลทรรศน์ทำงานได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น ลดจำนวนแสงจ้า และปรับปรุงความแม่นยำในการโฟกัสลำแสง ในตัวอย่าง เลเซอร์ไม่ได้ส่องสว่างทั่วทั้งขอบเขตการมองเห็น เช่นเดียวกับในกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบหลอด แต่จะโฟกัสไปที่จุดใดจุดหนึ่ง แน่นอน ในกรณีนี้ ลำแสงเลเซอร์จะกระตุ้นการเรืองแสงทั้งที่จุดโฟกัสและในทุกชั้นของตัวอย่างที่แสงผ่านไป และหากการเรืองแสงที่อยู่นอกโฟกัสที่ปล่อยออกมาจากเลเยอร์ด้านบนและด้านล่างระนาบโฟกัสถูกบันทึกพร้อมกับสัญญาณหลักจากการโฟกัสของเลนส์ ความละเอียดของระบบออพติคอลจะลดลง ไดอะแฟรมคอนโฟคอลช่วยให้คุณกำจัดแสงฟลูออเรสเซนต์ที่อยู่นอกโฟกัสได้ ด้วยการเปลี่ยนเส้นผ่านศูนย์กลางของไดอะแฟรมคอนโฟคอล ทำให้สามารถกำหนดความหนาของชั้นออปติคอลใกล้กับโฟกัสของลำแสงเลเซอร์ได้ ดังนั้นการเรืองแสงที่ปล่อยออกมาด้านบนและด้านล่างโฟกัสจึงพร่ามัวบนไดอะแฟรมคอนโฟคอลและจะไม่ถูกบันทึกไว้ ด้วยเหตุนี้ กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลจึงให้ความละเอียดที่ดีขึ้น โดยหลักๆ จะอยู่ตามแนวแกน Z

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลสมัยใหม่ทำให้สามารถแก้ปัญหาหลักสามประการได้ ได้แก่ การศึกษาโครงสร้างที่ดีของเซลล์ การรวมตัวกัน (การจัดเรียงเชิงพื้นที่) ของสารตั้งแต่สองชนิดขึ้นไปในเซลล์ ตลอดจนการศึกษากระบวนการไดนามิกที่เกิดขึ้นในเซลล์ที่มีชีวิต

ด้วยความละเอียดที่ได้รับการปรับปรุง โดยเฉพาะความละเอียดของแกน Z ที่เพิ่มขึ้น และความสามารถในการสร้างชุดส่วน "ออปติคัล" กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลจึงช่วยให้คุณศึกษาโครงสร้างเล็กๆ น้อยๆ ของวัตถุในสามมิติได้ โปรแกรมพิเศษช่วยให้คุณสร้างภาพสามมิติของวัตถุ (3D) จากชุดของส่วนแสงและจากมุมมองที่แตกต่างกันซึ่งสามารถให้ข้อมูลที่มีค่าเกี่ยวกับรูปร่างของเซลล์โครงร่างโครงร่างเซลล์ โครงสร้างของนิวเคลียส โครโมโซม และแม้แต่การแปลยีนแต่ละยีนในนั้น รวมถึงตำแหน่งสัมพัทธ์ขององค์ประกอบเหล่านี้

การใช้โหมดการทำงานแบบหลายสเปกตรัม (ที่มีฟลูออโรโครมหลายตัว) ของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบสแกนด้วยเลเซอร์ ทำให้สามารถศึกษาการรวมตัวกัน (การจัดเรียงร่วมกันเชิงพื้นที่) ในเซลล์ที่มีสารสองชนิดหรือมากกว่าที่แตกต่างกัน เช่น โปรตีนที่ติดฉลากด้วยสีย้อมเรืองแสงที่แตกต่างกัน เมื่อตรวจสอบการเตรียมการดังกล่าวในกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบธรรมดา เป็นไปไม่ได้ที่จะพูดด้วยความมั่นใจว่าสารเหล่านี้อยู่ติดกันหรืออยู่ข้างกัน ด้วยการใช้วิธีการตัดส่วนแสงและการสร้างวัตถุขึ้นใหม่แบบ 3 มิติ ทำให้สามารถสร้างการกระจายตัวตามปริมาตรของสารขึ้นมาใหม่ได้ โหมดมัลติสเปกตรัมยังช่วยให้สามารถศึกษา FISH บนกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลได้

วิธีการใช้กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลทำให้สามารถระบุความสามารถของสารในการสะสมในไซโตพลาสซึม นิวเคลียส หรือโครงสร้างเซลล์อื่นๆ บันทึกการก่อตัวของสารเมตาโบไลต์ วัดจลนศาสตร์ของการสะสมและเมแทบอลิซึมของสารในเซลล์ อัตราการกำจัดสารออกจาก เซลล์และเปรียบเทียบความเข้มข้นของการเผาผลาญในเซลล์ไลน์ต่างๆ และภายใต้สภาวะที่ต่างกัน วิธีการเหล่านี้มีการใช้กันมากขึ้นในการศึกษากลไกการออกฤทธิ์ของทั้งสารก่อมะเร็งและยาและสารประกอบต้านมะเร็ง และทำให้สามารถคำนวณความเข้มข้นที่มีประสิทธิผลได้

การวิเคราะห์ความเข้มและรูปร่างของสเปกตรัมเรืองแสงจากภายในทำให้สามารถจดจำเซลล์ปกติและเซลล์อักเสบได้ และโดยเฉพาะวิธีนี้ ได้รับการเสนอให้เป็นวิธีการใหม่ในการวินิจฉัยปากมดลูกตั้งแต่เนิ่นๆ

ด้วยการเลือกตัวกรองร่วมกันสำหรับการเรืองแสงจากภายในหลายประเภท ทำให้เป็นไปได้โดยไม่ต้องทำการย้อมสีฮิสโตเคมีและการได้มาและการตรวจสอบหลายส่วนซึ่งต้องใช้แรงงานจำนวนมาก เพื่อแยกแยะระหว่างโครงสร้างเนื้อเยื่อที่เป็นมะเร็งและปกติในตัวอย่างชิ้นเนื้อของต่อมน้ำเหลืองจากผู้ป่วยที่เป็นมะเร็งต่อมน้ำเหลือง ของต้นกำเนิดต่างๆ

วิธีการใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลใช้กันอย่างแพร่หลายในด้านคัพภวิทยาและอุทกชีววิทยา พฤกษศาสตร์ สัตววิทยา ในการศึกษาโครงสร้างของเซลล์สืบพันธุ์ การพัฒนาและการก่อตัวของสิ่งมีชีวิต

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเป็นหนึ่งในวิธีการของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงซึ่งมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกล้องจุลทรรศน์แบบคลาสสิก เนื่องจากการใช้ไดอะแฟรมที่ตัดการไหลของแสงที่กระเจิงในพื้นหลัง ในกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล ภาพจุดหนึ่งของวัตถุจะถูกบันทึกในแต่ละช่วงเวลา และสร้างภาพเต็มโดยการสแกน (ย้ายตัวอย่างหรือจัดเรียงระบบออพติคอลใหม่) เพื่อบันทึกแสงจากจุดเดียว ไดอะแฟรมขนาดเล็กจะตั้งอยู่หลังเลนส์ใกล้วัตถุในลักษณะที่แสงที่ปล่อยออกมาจากจุดที่วิเคราะห์ผ่านไดอะแฟรมและจะถูกบันทึกไว้ และแสงจากจุดที่เหลือส่วนใหญ่จะล่าช้าออกไป โดยไดอะแฟรม

การเพิ่มคอนทราสต์ของภาพยังเกิดขึ้นได้เนื่องจากไฟส่องสว่างไม่ได้สร้างแสงสว่างที่สม่ำเสมอในมุมมอง แต่จะเน้นแสงไปที่จุดที่วิเคราะห์ ซึ่งสามารถทำได้โดยการวางระบบโฟกัสที่สองไว้ด้านหลังตัวอย่าง แต่ตัวอย่างจะต้องโปร่งใส นอกจากนี้ เลนส์ใกล้วัตถุมักจะมีราคาแพง ดังนั้นการใช้ระบบโฟกัสที่สองเพื่อให้แสงสว่างจึงไม่ค่อยมีประโยชน์ อีกทางเลือกหนึ่งคือการใช้ตัวแยกลำแสงเพื่อให้ทั้งแสงตกกระทบและแสงสะท้อนถูกโฟกัสด้วยเลนส์เพียงตัวเดียว โครงการนี้ยังทำให้การปรับเปลี่ยนง่ายขึ้น

การลดรูในไดอะแฟรมทำให้ความหนาของชั้นแสงลดลง ซึ่งจะเพิ่มคอนทราสต์ของภาพ แต่ในขณะเดียวกันความสว่างก็ลดลง ซึ่งต้องใช้ระบบบันทึกที่มีความไวสูงและในระหว่างกระบวนการวิจัย บังคับให้มีการประนีประนอมระหว่างความสว่างและคอนทราสต์ของภาพที่ได้

งานที่พบบ่อยที่สุดสำหรับกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล เนื่องจากมีความละเอียดและคอนทราสต์สูง คือการศึกษาโครงสร้างของเซลล์และออร์แกเนลของเซลล์ เช่น โครงร่างโครงร่างของเซลล์ ER ไลโซโซม ไมโตคอนเดรีย นิวเคลียส โครโมโซม และแม้กระทั่งยีน นอกจากนี้ยังมีการศึกษาการรวมตัวกันในเซลล์ที่มีสารตั้งแต่สองชนิดขึ้นไป งานอีกประการหนึ่งคือศึกษากระบวนการไดนามิกที่เกิดขึ้นในเซลล์ที่มีชีวิต ตัวอย่างเช่น การขนส่งทางเซลล์ของสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพ การเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นและการกระจายตัวของแคลเซียมไอออน ด้วยการบันทึกชุดส่วนแสงในหน่วยความจำของคอมพิวเตอร์ จึงเป็นไปได้ที่จะดำเนินการสร้างวัตถุขึ้นใหม่ตามปริมาตรและรับภาพสามมิติโดยไม่ต้องใช้เทคนิคที่ใช้แรงงานมากในการผลิตและถ่ายภาพส่วนเนื้อเยื่อวิทยาแบบอนุกรม

พื้นที่ใหม่ที่มีแนวโน้มดีคือเทคนิค FRAP - Fluorescence Recovery After Photobleaching และ FRET - Fluorescence Resonance Energy Transfer

อภิธานศัพท์:

FRAPใช้เพื่อศึกษาการเคลื่อนที่ของโมเลกุลชีวอินทรีย์ผ่านการเริ่มต้นการสลายตัวด้วยแสงเคมีของฟลูออโรโครมในเขตการฉายรังสี และการแยกตัวออกจากโมเลกุลในเวลาต่อมา หลังจากการเผาไหม้ โมเลกุลที่มีฟลูออโรโครมจากโซนที่ไม่มีการฉายรังสีจะเคลื่อนที่เนื่องจากการแพร่กระจายไปยังโซนที่ถูกฉายรังสีของตัวอย่าง เมื่อถึงเวลาที่การเรืองแสงเพิ่มขึ้นเราสามารถตัดสินการเคลื่อนที่ของโมเลกุลได้

หงุดหงิดใช้เพื่อกำหนดระยะห่างระหว่างโมเลกุลประเภทต่างๆ สภาพแวดล้อม และปฏิสัมพันธ์ของมัน โมเลกุลจะมีป้ายกำกับด้วยฟลูออโรโครมสองตัวซึ่งมีสเปกตรัมการแผ่รังสีของผู้บริจาคซ้อนทับกับสเปกตรัมการดูดกลืนแสงของตัวรับ พลังงานถูกถ่ายโอนจากผู้บริจาคไปยังผู้รับในระยะทางสั้นๆ (หลายนาโนเมตร) อันเป็นผลมาจากการสั่นพ้องระหว่างระดับพลังงาน และความน่าจะเป็นขึ้นอยู่กับระยะห่างระหว่างโมเลกุล จากนั้นตัวรับจะปล่อยพลังงานออกมาในบริเวณที่มองเห็นได้ของสเปกตรัม ซึ่งถูกบันทึกด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล

กล้องจุลทรรศน์สองโฟตอน (มัลติโฟตอน) -สองโฟตอน (มัลติโฟตอน)กล้องจุลทรรศน์- เทคนิคที่ได้มาจากกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลสแกนด้วยเลเซอร์ ซึ่งฟลูออโรโครมถูกกระตุ้นด้วยการแผ่รังสีเลเซอร์ในช่วงอินฟราเรดหรือช่วงที่มองเห็นเป็นคลื่นยาว ซึ่งมีความหนาแน่นเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่าหรือสามเท่า ณ จุดโฟกัสบนตัวอย่าง ฟลูออโรฟอร์ตัวอย่างถูกกระตุ้นโดยโฟตอนที่มีความยาวคลื่นยาวสองหรือสามตัว ซึ่งเทียบเท่ากับการกระตุ้นด้วยโฟตอนความยาวคลื่นสั้นหนึ่งตัว ตัวอย่างเช่น การกระตุ้นด้วยโฟตอน 900 นาโนเมตรสองหรือสามตัวจะเทียบเท่ากับการกระตุ้นด้วยโฟตอน 450 หรือ 300 นาโนเมตรหนึ่งตัว กล้องจุลทรรศน์มัลติโฟตอนช่วยให้เจาะเนื้อเยื่อได้ลึกยิ่งขึ้น และไม่ต้องใช้ไมโครไดอะแฟรมคอนโฟคอล เนื่องจากการเรืองแสงจะเกิดขึ้นในระนาบโฟกัสอย่างเคร่งครัด

ฟิลเตอร์ปรับเสียงอะคูสติกออปติคอล (ทอท.) -อะคูสติก-จักษุปรับได้กรอง (ทอท.)- อุปกรณ์กรองที่ใช้การสั่นสะเทือนของเสียงเพื่อปรับความยาวคลื่นหรือความเข้มของแสงที่ปล่อยออกมาจากเลเซอร์หรือแหล่งกำเนิดแสงที่ไม่ต่อเนื่องกัน (หลอดอาร์คเป็นหลัก) ตัวกรองประกอบด้วยคริสตัลเฉพาะทาง (เทลลูเรียมออกไซด์หรือควอตซ์) ซึ่งยึดไว้ทั้งสองด้านด้วยตัวปล่อยเสียงและตัวดูดซับ เพื่อกระตุ้นคลื่นเสียงนิ่งในคริสตัลโดยมีโซนการหักเหของแสงสูงและต่ำที่แปรผันได้ หากแสงโพลาไรซ์หรือแสงไม่มีโพลาไรซ์ผ่านฟิลเตอร์ คริสตัลจะทำหน้าที่เป็นตะแกรงการเลี้ยวเบน ซึ่งจะเบนแสงที่ส่องผ่าน ในการเปลี่ยนคาบของตะแกรงเลี้ยวเบน ความยาวของลักษณะเฉพาะของคลื่นนิ่งจะถูกเลือก ซึ่งเป็นผลมาจากการเปลี่ยนแปลงของการสั่นสะเทือนของเสียงที่ส่งไปยังคริสตัล

ตัวกรองแบนด์พาส -แบนด์พาสกรอง- ตัวกรองที่ส่งช่วงความยาวคลื่นบางช่วง (แถบ) ขณะเดียวกันก็ลดทอนคลื่นที่มีความยาวมากกว่าและสั้นกว่าที่ส่ง ความยาวคลื่นที่อยู่ตรงกลางของย่านความถี่ที่ส่งมักจะเรียกว่าค่าเฉลี่ย (ตัวย่อภาษาอังกฤษ CWL) แบนด์วิธที่มีประสิทธิภาพวัดจากความกว้างของโซนที่ส่งผ่านครึ่งหนึ่งของแสงตกกระทบสูงสุด หรือที่เรียกว่าครึ่งหนึ่งของแบนด์วิธ (ตัวย่อ FWHM และ HBW) ในกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ ตัวกรองแบนด์พาสมักใช้ในเส้นทางการกระตุ้น และมักใช้เป็นตัวกรองเกณฑ์ (สิ่งกีดขวาง) น้อยกว่า

แยกลำแสง -แยกลำแสง- อุปกรณ์ออพติคัลที่ใช้ในการแยกลำแสงตกกระทบออกเป็นสองส่วนขึ้นไป โดยแต่ละส่วนจะฉายไปในทิศทางที่ต่างกัน ตัวแยกลำแสงมีรูปแบบที่หลากหลายเพื่อให้ตรงตามเงื่อนไขเฉพาะ หน่วยช่องมองภาพของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงใช้ตัวแยกลำแสงแบบแท่งปริซึมเพื่อฉายภาพไปยังช่องมองภาพและกล้องไปพร้อมๆ กัน (กล้องดิจิตอล) เพื่อให้ได้แสงโพลาไรซ์เชิงเส้น จึงมีการใช้ตัวแยกลำแสงโพลาไรซ์ที่ทำจากควอตซ์ธรรมชาติ ซึ่งเป็นวัสดุที่มีการหักเหสองเท่า ในกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ กระจกไดโครมาติก (ไดโครอิก) ถูกใช้เป็นตัวแยกลำแสงเพื่อสะท้อนคลื่นกระตุ้นกลับไปยังแหล่งกำเนิด และส่งรังสีฟลูออเรสเซนต์ทุติยภูมิที่มีความยาวคลื่นยาวไปยังเลนส์ใกล้ตาและเครื่องตรวจจับ

กระจกบานเย็น -เย็นกระจกเงา- ตัวกรองสัญญาณรบกวนแบบไดโครมาติกแบบพิเศษที่สะท้อนสเปกตรัมที่มองเห็นได้ทั้งหมดในช่วงอุณหภูมิที่กว้างมาก แต่ส่งคลื่นในบริเวณอินฟราเรดได้อย่างมีประสิทธิภาพมาก เช่นเดียวกับกระจกร้อน กระจกเย็นสามารถออกแบบให้สะท้อนแสงที่ตกในมุมตั้งแต่ศูนย์ถึง 45 องศา และประกอบด้วยการเคลือบอิเล็กทริกหลายชั้น เช่น ตัวกรองสัญญาณรบกวน กระจกเย็นสามารถใช้เป็นตัวแยกลำแสงไดโครมาติกในระบบเลเซอร์เพื่อสะท้อนแสงที่มองเห็นและส่งผ่านแสงอินฟราเรด

ตัวแยกลำแสงแบบไดโครเมติก (กระจกไดโครอิก) -ไดโครมาติกแยกลำแสง (ไดโครอิกกระจกเงา)- การรวมตัวกรองสัญญาณรบกวน/กระจกที่ใช้กันทั่วไปในชุดตัวกรองด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์เพื่อสร้างการเปลี่ยนแปลงที่ชัดเจนระหว่างความยาวคลื่นที่ส่งผ่านและสะท้อน กระจกไดโครมาติกซึ่งเอียง 45 องศาไปยังแสงตกกระทบและปล่อยรังสี จะสะท้อนรังสีกระตุ้นด้วยคลื่นสั้นที่มุม 90 องศาไปยังตัวอย่าง และส่งรังสีความยาวคลื่นที่ยาวกว่าจากตัวอย่างไปยังเลนส์ใกล้ตาและเครื่องตรวจจับ กระจกไดโครมาติกสำหรับกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ซึ่งสร้างโดยใช้ฟิล์มรบกวนบางๆ สามารถสะท้อนรังสีที่น่าตื่นเต้นได้มากถึง 90% ขณะเดียวกันก็ส่งแถบรังสีฟลูออเรสเซนต์ได้มากถึง 90% ในเวลาเดียวกัน กระจกไดโครมาติกมักเป็นองค์ประกอบส่วนกลาง (หลัก) ในฟิลเตอร์สามประเภท (กระจกกระตุ้น กระจกกั้น และกระจกไดโครมาติก) ที่พบในชุดกรองแสงฟลูออเรสเซนต์

ทางลาดกรอง -กรองความลาดชัน- ความชันของฟิลเตอร์ออปติคัลเป็นลักษณะของโปรไฟล์ฟิลเตอร์ในพื้นที่ของการเปลี่ยนจากการปิดกั้นไปสู่การส่งสัญญาณ โดยทั่วไป ความชันของตัวกรองมีลักษณะเฉพาะด้วยความยาวคลื่นที่ตัวกรองแสดงการส่งผ่านบางอย่าง และความชันของการตอบสนองที่ตำแหน่งนั้น ตัวกรองสองตัวที่แตกต่างกันอาจมีความถี่จุดตัดเท่ากัน แต่ระดับจุดตัดและการหมุนต่างกันโดยสิ้นเชิง ตัวกรองที่มีความลาดชันมากจะมีแบนด์วิธที่แคบ ในขณะที่ความลาดชันที่ตื้นหมายถึงแบนด์วิธที่กว้าง

ความกว้างเต็มสูงสุดเพียงครึ่งเดียว -เต็มความกว้างที่ครึ่งขีดสุด (FWHM)- ช่วงความยาวคลื่นที่ส่งผ่านกระจกหรือตัวกรองสัญญาณรบกวนอธิบายโดยพารามิเตอร์ที่เรียกว่าความกว้างเต็มที่ครึ่งหนึ่งสูงสุด (FWHM) ขอบเขตจุดตัดถูกกำหนดให้เป็นความยาวคลื่นที่สั้นที่สุดและใหญ่ที่สุดที่ส่งผ่านตัวกรองที่ 50% ของค่าสูงสุด และความยาวคลื่นเฉลี่ย (CWL หรือ CWL) คือค่าเฉลี่ยเลขคณิตของความยาวคลื่นทั้งหมดภายในช่วง ตัวอย่างเช่น ค่า FWHM 40 หมายความว่าช่วงความยาวคลื่นที่ส่งคือ 40 นาโนเมตร และค่า CWL สามารถอยู่ที่ใดก็ได้ตั้งแต่รังสีอัลตราไวโอเลตไปจนถึงอินฟราเรดของสเปกตรัม ในข้อความหลายฉบับ FWHM อาจเรียกว่าครึ่งแบนด์วิธ (HBW)

กล้องวิดีโอใช่ไหม-เพิ่มความเข้มข้นซิลิคอน-เพิ่มความเข้มข้นเป้า (ใช่ไหม)กล้อง- กล้องวิดีโอที่ออกแบบมาเพื่อใช้งานในระดับแสงน้อย เช่น ในกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ของตัวอย่างที่ให้ผลผลิตควอนตัมต่ำมาก โดยทั่วไปแล้ว กล้องเหล่านี้จะมีท่อ SIT (ที่มีอาร์เรย์ไดโอด) เสริมด้วยตัวเพิ่มความเข้มของภาพร่วมกับใยแก้วนำแสงในขั้นตอนการขยายแสงระยะแรก

กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงสแกนระยะใกล้ (LSOM)) - ใกล้-สนามกำลังสแกนออปติคัลกล้องจุลทรรศน์ (นศอม)- การถ่ายภาพระยะใกล้ทำได้โดยการวางโพรบแสงขนาดต่ำกว่าไมครอน (ตัวนำแสง) ใกล้กับวัตถุที่กำลังศึกษาอย่างมาก และส่งแสงผ่านไดอะแฟรมขนาดเล็กที่ส่วนท้ายของโพรบ สนามใกล้เข้าใจว่าเป็นโซนเหนือพื้นผิวของวัตถุที่กำลังศึกษาซึ่งมีขนาดเล็กกว่าความยาวคลื่นของแสงที่ตกกระทบ ภายในสนามระยะใกล้ แสงที่หายไปไม่ถูกจำกัดด้วยการเลี้ยวเบน และสามารถรับข้อมูลเกี่ยวกับวัตถุขนาดนาโนเมตรได้ ปรากฏการณ์นี้ทำให้สามารถได้ภาพที่เกินขอบเขตการเลี้ยวเบน และทำการตรวจสเปกโทรสโกปีของตัวอย่างที่ไม่สามารถบรรลุได้โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงแบบธรรมดา