Konfokalna mikroskopija. Konfokalna intravitalna mikroskopija roženice Konfokalna fluorescenčna mikroskopija

Luminescentna ali fluorescentna mikroskopija- metoda histološke analize s fluorescenčnim mikroskopom, ki uporablja pojav luminiscence (sijaj) snovi pri izpostavljenosti kratkovalovnim žarkom (ultravijolična svetloba, rentgenski žarki). Za nekatere biološke spojine, prisotne v celicah, je značilna spontana fluorescenca, ko ultravijolični žarki zadenejo celico. Za odkrivanje večine drugih spojin celice obdelamo s posebnimi fluorokromi (fluorescein, akridin oranž, korifosfin). Fluorokromi se uporabljajo za preučevanje, na primer, vsebnosti nukleinskih kislin v celicah. Ko je obarvan z akridinom, DNA daje rdeče-zelen sijaj, RNA pa oranžno.

Fluorescenčni mikroskopŠiroko se uporablja tudi za preučevanje imunofluorescence. Imunofluorescenca omogoča preučevanje vsebnosti zelo majhnih količin beljakovin v celici. Zdravilo je predhodno obdelano s protitelesi proti preučevanemu proteinu, označenim s fluorescentnim barvilom.

Ultravijolična mikroskopija- metoda preučevanja celic z uporabo mikroskopov, ki uporabljajo ultravijolične žarke (valovna dolžina 210-275 nm) za osvetlitev predmeta. Takšni mikroskopi imajo večjo ločljivost kot običajni svetlobni mikroskopi. Za opazovanje predmeta je potrebna posebna oprema - elektronsko-optični pretvornik, ki ščiti organ vida pred delovanjem ultravijoličnih žarkov.

Elektronska mikroskopija. Elektronski mikroskopi uporabljajo žarek elektronov, katerih elektromagnetna valovna dolžina je 100.000-krat krajša od valovne dolžine vidne svetlobe. Ločljivost elektronskega mikroskopa je več sto in tisočkrat višja od običajnih optičnih instrumentov in je enaka 0,5-1 nm, sodobni megavoltni elektronski mikroskopi pa zagotavljajo povečanje do 1.000.000-krat. Z uporabo elektronskih mikroskopov so bili pridobljeni številni podatki o ultrastrukturi celic. Vrsta elektronske mikroskopije je vrstična elektronska mikroskopija (SEM), ki proučuje površinske strukture celic.

Citospektrofotometrija- metoda za preučevanje kemične sestave celice, ki temelji na selektivni absorpciji žarkov z določeno valovno dolžino določenih snovi. Na podlagi intenzivnosti absorpcije svetlobe, ki je odvisna od koncentracije snovi, kvantitativno določimo njeno vsebnost v celici.

Avtoradiografija- pomembna informativna metoda, ki vam omogoča preučevanje porazdelitve snovi v celicah in tkivih, v katere so umetno uvedeni radioaktivni izotopi (3H, HC, 32P itd.). Izotop, vnesen v telo živali (ali v medij celične kulture), je vključen v ustrezne strukture (na primer označen timidin - v jedrih celic, ki sintetizirajo DNK). Metoda temelji na sposobnosti izotopov, vključenih v celice, da reducirajo srebrov bromid v fotografski emulziji, ki prekriva tkivne dele ali celice. Srebrna zrna (sledi), ki nastanejo po razvoju fotografske emulzije, služijo kot neke vrste avtogrami, po katerih lokalizaciji presojamo vključenost snovi, ki se uporabljajo v celici. Uporaba s tritijem označenih prekurzorjev nukleinskih kislin (timidin, adenin, citidin, uridin) je omogočila razjasnitev številnih pomembnih vidikov sinteze DNA, RNA in celičnih proteinov.

Histo- in imunocitokemične metode. Temeljijo na uporabi kemijskih reakcij za ugotavljanje porazdelitve kemikalij v strukturah celic, tkiv in organov. Sodobne histokemične metode omogočajo odkrivanje aminokislin, proteinov, nukleinskih kislin, različnih vrst ogljikovih hidratov, lipidov itd. Za identifikacijo specifičnih proteinov se uporabljajo imunocitokemične reakcije. Da bi to naredili, pridobimo specifične serume, ki vsebujejo protitelesa (na primer proti proteinu mikrotubulov - tubulinu). Nato se ta protitelesa kemično kombinirajo s fluorokromom (ali drugim markerjem). Če označena protitelesa nanesemo na histološki rez, se združijo z ustreznimi celičnimi proteini in pojavi se specifičen sij, viden v fluorescentnem mikroskopu. Sodobne imunocitokemične metode poleg fluorokromov uporabljajo široko paleto drugih specifičnih markerjev, ki omogočajo kvalitativno in kvantitativno oceno vsebnosti proučevanih spojin v celici. Modifikacija obravnavane metode je vnos označenih protiteles v citoplazmo živih celic z uporabo mikromanipulatorjev.

Metoda celične kulture, tkiva sestavljajo rastoče celice in tkiva zunaj telesa v umetnih hranilnih medijih (pogoji in vitro). Za pridobitev izoliranih celic material predhodno obdelamo z encimoma tripsinom ali kolagenazo. Metoda omogoča preučevanje odzivov celic na različne vplive, mehanizme regulacije proliferacije, diferenciacije in smrti. Ta metoda je še posebej pomembna za embriološke in citofiziološke študije ter za presaditev embrionalnih celic pri zdravljenju prirojenih in pridobljenih presnovnih napak.

Mikroskopska celična kirurgija- niz metodoloških tehnik, ki se izvajajo s posebno napravo - mikromanipulatorjem. Ta naprava omogoča izvajanje različnih vrst delikatnih operacij na celici (vnos snovi, odstranitev ali presaditev strukturnih komponent celice, injekcije, zareze itd.) In je našla široko uporabo v embriologiji.

Časovni zamik ali počasni posnetek, mikrokino ali video snemanje - preučevanje živih celic. Ta metoda vam omogoča spremljanje počasnih sprememb v celicah.

Metoda frakcioniranja(diferencialno centrifugiranje) celic. Njegovo bistvo je v pridobivanju izoliranih strukturnih komponent iz celic. Temelji na različnih hitrostih sedimentacije teh komponent med rotacijo celičnih homogenatov v ultracentrifugah. Ta metoda je imela in še vedno igra zelo pomembno vlogo pri preučevanju kemične sestave in funkcionalnih lastnosti subceličnih elementov - predvsem organelov.

Konfokalna mikroskopija- sodobna metoda, ki kot osvetljevalec uporablja laserski žarek, ki zaporedno skenira celotno debelino zdravila. Podatki o gostoti predmeta vzdolž vsake vrstice skeniranja se prenesejo v računalnik, kjer poseben program izvede tridimenzionalno rekonstrukcijo preučevanega predmeta.

Intenzivno se razvija tudi optična mikroskopija z uporabo najnovejših dosežkov tehnologije, informacijske in računalniške tehnologije. To vodi v izboljšanje obstoječe opreme in načinov njene uporabe, kar vodi v nastanek novih metod, zlasti konfokalne mikroskopije.

Konfokalni mikroskop se od »klasične« optične naprave razlikuje po tem, da se v vsakem trenutku posname slika ene točke predmeta, s skeniranjem (premikanje vzorca ali preureditev optičnega sistema) pa se zgradi popolna slika. Tako je princip vrstične elektronske mikroskopije implementiran v edinstveni obliki, ki omogoča snemanje in obdelavo signala iz vsake posamezne točke poljubno dolgo.

Pri običajnem mikroskopu vstopi svetloba v fotodetektor istočasno iz različnih točk vzorca. Pri konfokalnem mikroskopu je za snemanje svetlobe samo iz ene točke za lečo objektiva nameščena majhna diafragma tako, da svetloba, ki jo oddaja analizirana točka, prehaja skozi zaslonko in se posname, svetloba iz drugih točk pa zadržuje diafragma, kot je prikazano na sl. 15.31.

riž. 15.31

Druga značilnost je, da osvetljevalec ne ustvarja enakomerne osvetlitve vidnega polja, temveč fokusira svetlobo v bližini analizirane točke. To lahko dosežemo tako, da za vzorec postavimo drugi sistem za fokusiranje, vendar to zahteva, da je vzorec prozoren. Poleg tega so objektivi običajno dragi, zato uporaba drugega sistema ostrenja za osvetlitev ni vedno upravičena. Druga možnost je uporaba razdelilnika žarka, tako da tako vpadno kot odbito svetlobo fokusirata ena leča. Ta shema tudi olajša prilagajanje.

Oglejmo si zdaj matematični model za kvantitativno oceno spremembe kontrasta pri uporabi konfokalne mikroskopije. Ker gre svetloba skozi lečo dvakrat v konfokalnem mikroskopu, je funkcija zamegljenosti točke produkt neodvisnih verjetnosti, da bo foton zadel točko z njenimi koordinatami in da bo foton, ki zapusti to točko, zaznan.

V skladu z Rayleighovim kriterijem ločljivosti se izkaže, da se ločljivost v konfokalnem mikroskopu poveča, vendar ne bistveno. Za konfokalni mikroskop imamo izraz za ločljivost G

Medtem ko za običajni mikroskop

kjer je A." = H/n; p- lomni količnik; 0 - kot odprtine; D- premer odprtine; F- Goriščna razdalja.

Glavna prednost konfokalnega mikroskopa ni povečanje ločljivosti (v smislu Rayleighovega kriterija), temveč znatno povečanje kontrasta. Zatemnjen predmet z intenzivnostjo, na primer 200-krat manjšo od svetlega, v običajnem mikroskopu ni viden, čeprav je lahko razdalja med objekti veliko večja od tiste, ki jo predpisuje Rayleighov kriterij. Nasprotno, konfokalni mikroskop bi moral registrirati tak objekt.

Pomemben parameter je velikost odprtin v goriščni ravnini sevalne in zbiralne leče. Slika diafragme v ravnini objekta določa svetlobo, iz katerih področij posname fotodetektor. Jasno pa je, da zmanjšanje velikosti zaslonke zmanjša količino prepuščene svetlobe, zmanjša razmerje med signalom in šumom in na koncu lahko izniči vse dosežene prednosti kontrasta. Tako se postavlja vprašanje optimalne izbire velikosti zaslonke in razumnega kompromisa.

Zaslonka z odprtino, manjšo od Airyjeve točke, preprosto povzroči izgubo intenzivnosti in ne vpliva na ločljivost. Velikost zaslonke ene točke Airy omogoča največji izkoristek ločljivosti leče objektiva. Toda velikost zaslonke, ki je približno 3-5-krat večja od Airyjeve točke, se zdi najprimernejša. Razumeti je treba, da se tukaj obravnavana velikost nanaša na velikost slike v ravnini objekta, zato je dejanska velikost odprtine zaslonke odvisna od povečave leče. Natančneje, pri uporabi 100-kratne leče bo zaslonka z odprtino 1 mm projicirala v ravnino predmeta v krog s polmerom 10 µm.

Razvoj ideje konfokalne mikroskopije je bil razvoj konfokalni laserski vrstični mikroskop(CLSM), ki je nastala zaradi potrebe po občutljivejših in meroslovno strožjih načinih analize oblike in prostorske strukture opazovanih objektov. Diagram CLSM z glavnimi funkcionalnimi povezavami je prikazan na sl. 15.32.

riž. 15.32.1 - koordinatna miza; 2- preskusni vzorec;

3,6 - leče; 4 - naprava za skeniranje; 5 - cepilnik žarka; 7, 9- igelne diafragme; 8- sprejemnik sevanja; 10 - laser; 11 - Krmilni blok; 12 - računalnik; 13 - pogon za skeniranje vzdolž osi Z

Posebnost CLSM je možnost poplastnega slikanja preučevanega predmeta z visoko ločljivostjo in nizko stopnjo šuma. To dosežemo s postopnim skeniranjem predmeta s fokusiranim snopom svetlobe iz koherentnega vira ali s pomočjo mize s posebnimi fluorescentnimi sondami ter posebnimi metodami za omejevanje svetlobnih tokov.

Ločljivost CLSM določata tako optični sistem kot pot elektronske obdelave informacij. Zato je treba pri načrtovanju CLSM in njegovih vezij uskladiti parametre, kot so ločljivost optičnega sistema, korak skeniranja, karakteristike detektorja, poleg tega pa je treba izbrati optimalne algoritme obdelave in ustrezno programsko opremo.

Na splošno je globinska ostrina CLSM odvisna od zaslonke, valovne dolžine, koherence svetlobnih virov in velikosti igelne diafragme. Igelna diafragma(ID) je glavni element oblikovanja, ki razlikuje CLSM od drugih vrst mikroskopov. Igelne diafragme so zasnovane tako, da ustvarjajo pogoje za maksimalno ali popolno filtracijo svetlobe, ki vstopa v ravnino oblikovanja slike iz točk, ki ne sovpadajo z goriščno ravnino ali se nahajajo poleg analiziranega elementa predmeta v goriščni ravnini.

Izbira optimalnega ID premera je pomembna za pridobitev zahtevanih lastnosti naprave. Relacije za oceno stranske ločljivosti in globinske ostrine CLSM so pridobljene ob predpostavki, da ima ID majhno zaslonko in je svetleča točka. V resnici je velikost ID končna, od nje je odvisna stranska ločljivost naprave, svetlost osvetljenih elementov preparata, premaknjena glede na goriščno ravnino vzdolž osi Z, in globinska ostrina.

Z majhnim premerom ID postane svetlobni tok nizek, kar zmanjša razmerje med signalom in šumom ter zmanjša kontrast. Pri velikem premeru se učinkovitost diafragme zmanjša z zmanjšanjem zaslonke.

Konfokalna mikroskopija- ena izmed sodobnih raziskovalnih metod; omogoča intravitalno spremljanje stanja roženice z vizualizacijo tkiva na celični in mikrostrukturni ravni.

Ta metoda zaradi izvirne zasnove mikroskopa in visoke ločljivosti omogoča vizualizacijo živega tkiva roženice, merjenje debeline vsake njene plasti in tudi oceno stopnje morfoloških motenj.

Opredeliti morfološke spremembe roženice, ki se pojavijo med različnimi vnetnimi in distrofičnimi boleznimi, pa tudi zaradi kirurških posegov in izpostavljenosti CL.

Podatki morfološkega pregleda so potrebni za oceno resnosti patološkega procesa, učinkovitosti zdravljenja in določitev taktike zdravljenja bolnika.

Indikacije

Vnetne bolezni roženice (keratitis).
Distrofične bolezni roženice (keratokonus, Fuchsova distrofija itd.).
Sindrom suhega očesa.
Stanja po kirurških posegih na roženici (presaditev roženice, keratorefraktivna kirurgija).
Pogoji, povezani z nošenjem CL.

Kontraindikacije

Relativna kontraindikacija je hudo draženje oči v ozadju akutnega vnetnega procesa.

Priprava

Izvajanje te študije mogoče brez uporabe anestetikov. Kapljico imerzijske tekočine damo na lečo objektiva konfokalnega mikroskopa. To odpravlja neposreden stik leče z roženico in zmanjšuje tveganje za poškodbe epitelija.

Metodologija

Študijo izvajamo na konfokalnem mikroskopu ConfoScan 4 (Nider) s 500-kratno povečavo. Naprava omogoča pregled roženice po celotni debelini.

Velikost proučevanega območja je 440x330 µm, debelina skenirnega sloja je 5 µm. Lečo s kapljico gela približamo roženici do dotika in jo kot tako namestimo. tako da je debelina sloja potopne tekočine 2 mm. Zasnova naprave vam omogoča pregled roženice v osrednjem območju in njenih paracentralnih odsekov (slika 7-1; slika 7-2.).

Tolmačenje

Normalna morfološka slika roženice

Sprednji epitelij je sestavljen iz 5-6 plasti celic. Povprečna debelina celotnega epitelija je približno 50 µm. Glede na morfološko strukturo ločimo naslednje plasti (od znotraj navzven): banalne, stiloidne celice in površinske.

Najbolj notranja (bazalna) plast je sestavljena iz majhnih, gostih, valjastih celic brez vidnega jedra. Meje bazalnih celic so jasne in svetle (slika 7-3).

Srednjo plast sestavljajo 2-3 plasti spinoznih (krilatih) celic z globokimi invaginacijami, v katere so vdelani izrastki sosednjih celic. Mikroskopsko so celične meje precej jasno vidne, vendar jedra morda niso definirana ali pa so nejasna (slika 7-4).

Površinski sloj epitelija predstavlja ena ali dve plasti poligonalnih celic z jasnimi mejami in homogeno gostoto. Jedra so običajno svetlejša od citoplazme, v kateri je razviden tudi perinuklearni temni obroč (slika 7-5).

Med celicami površinske plasti ločimo temne in svetle. Povečana odbojnost epitelijskih celic kaže na zmanjšanje stopnje njihovega metabolizma in začetek luščenja.

Bowmanova membrana je prozorna struktura, ki ne odbija svetlobe, zato je njena vizualizacija s konfokalno mikroskopijo običajno nemogoča.

Subbazalni živčni pleksus se nahaja pod Bowmanovo membrano. Običajno so živčna vlakna videti kot svetli trakovi, ki potekajo vzporedno s temnim ozadjem in so v stiku med seboj. Odbojnost (odbojnost) je lahko neenakomerna po dolžini vlakna (slika 7-6).

Roženična stroma zavzema od 80 do 90 % debeline roženice in je sestavljena iz celične in zunajcelične komponente. Glavni celični elementi strome so keratociti; predstavljajo približno 5% volumna.

Tipičen mikroskopski videz strome vključuje več svetlih teles nepravilne ovalne oblike (jedra keratocitov), ​​ki ležijo v prozornem temno sivem ali črnem matriksu. Običajno je vizualizacija zunajceličnih struktur nemogoča zaradi njihove prosojnosti. Stromo lahko pogojno razdelimo na podsloje: sprednji (nahaja se neposredno pod Bowmanovo membrano in predstavlja 10% debeline strome), anteromedialni, srednji in posteriorni.

Povprečna gostota keratocitov je večja v sprednji stromi, njihovo število postopoma upada proti zadnjim plastem. Gostota celic v sprednji stromi je skoraj dvakrat večja od gostote celic v posteriorni stromi (če gostoto celic v sprednji stromi vzamemo za 100 %, bo gostota celic v posteriorni stromi približno 53,7 %). V sprednji stromi imajo jedra keratocitov okroglo, fižolasto obliko, v posteriorni stromi pa so ovalna in bolj podolgovata (slika 7-7.7-8).

Jedra keratocitov se lahko razlikujejo po svetlosti. Različna sposobnost odbijanja svetlobe je odvisna od njihovega presnovnega stanja. Za svetlejše celice štejemo aktivirane keratocite (»stresne« celice), katerih delovanje je usmerjeno v vzdrževanje notranje homeostaze roženice. V normalnih pogojih in v vidnem polju najdemo posamezne aktivirane celice (sl. 7-9).

Živčna vlakna v sprednji stromi roženice so vidna v obliki svetlih homogenih trakov, ki pogosto tvorijo bifurkacije (sl. 7-10).

Descemetova membrana Običajno prozoren in ga ne vidimo s konfokalno mikroskopijo.

Posteriorni epitelij je enoplast šesterokotnih ali poligonalnih ravnih celic z enakomerno svetlo površino na ozadju jasnih temnih medceličnih meja (slika 7-11).

Naprava ima možnost ročnega ali avtomatskega izračuna gostote celic, njihove površine in koeficienta variabilnosti.

Patološke spremembe v strukturi roženice

Za keratokonus so značilne pomembne spremembe v sprednjem epiteliju in stromi roženice.

Sprednji epitelij. Odkrijejo se različne vrste epiteliopatije (slika 7-12).

Napredek v genskem inženiringu, proteomiki, biotehnologiji, sodobni farmaciji in biomedicini je omogočil hitro uvedbo novih tehnik konfokalne mikroskopije, ki se zdaj pogosto uporabljajo v celični biologiji.

Konfokalno fluorescenčno mikroskopijo lahko obravnavamo kot vrsto tradicionalne fluorescenčne mikroskopije, ki omogoča preučevanje notranje mikrostrukture celic, ne le fiksnih, ampak tudi živih, prepoznavanje mikroorganizmov, celičnih struktur in posameznih molekul ter opazovanje dinamičnih procesov v celicah. . Konfokalna fluorescenčna mikroskopija je poleg tega omogočila tridimenzionalno submikronsko ločljivost objekta in bistveno razširila možnost nedestruktivne analize transparentnih vzorcev. Večjo ločljivost dosežemo z uporabo laserjev v konfokalnih mikroskopih kot virov svetlobe in konfokalne diafragme za filtriranje neizostrene fluorescence. Prednost laserjev pred živosrebrnimi ali ksenonskimi žarnicami je monokromatičnost in velika paralelnost oddanega svetlobnega snopa. Te lastnosti laserskega sevanja zagotavljajo učinkovitejše delovanje optičnega sistema mikroskopa, zmanjšajo število bleščanja in izboljšajo natančnost fokusiranja svetlobnega žarka. Na vzorcu laser ne osvetli celotnega vidnega polja, kot pri fluorescenčnem mikroskopu z žarnico, ampak je fokusiran na točko. Seveda v tem primeru laserski žarek vzbuja fluorescenco tako v žarišču kot v vseh plasteh vzorca, skozi katere prehaja. In če se ta neizostrena fluorescenca, ki jo oddajajo plasti nad in pod goriščno ravnino, posname skupaj z glavnim signalom iz fokusa leče, poslabša ločljivost optičnega sistema. Konfokalna diafragma vam omogoča, da se znebite neizostrene fluorescence. S spreminjanjem premera konfokalne diafragme je mogoče določiti debelino optične plasti v bližini žarišča laserskega žarka, zato je fluorescenca, ki se oddaja nad in pod žariščem, defokusirana na konfokalni diafragmi in se ne zabeleži. Kot rezultat, konfokalna mikroskopija zagotavlja izboljšano ločljivost, predvsem vzdolž osi Z.

Sodobna konfokalna mikroskopija omogoča reševanje treh glavnih problemov: preučevanje fine strukture celice, kolokolizacije (prostorske razporeditve) dveh ali več snovi v celici, pa tudi preučevanje dinamičnih procesov, ki se pojavljajo v živih celicah.

Zahvaljujoč izboljšani ločljivosti, zlasti povečani ločljivosti osi Z, in zmožnosti ustvarjanja serije "optičnih" odsekov vam konfokalni mikroskop omogoča preučevanje fine strukture predmeta v treh dimenzijah. Posebni programi vam omogočajo, da ustvarite tridimenzionalno sliko predmeta (3D) iz niza optičnih odsekov in si jo tako rekoč ogledate iz različnih zornih kotov, kar lahko zagotovi dragocene informacije o obliki celic, citoskeletu , strukturo jedra, kromosomov in celo lokalizacijo posameznih genov v njih, pa tudi o relativnem položaju teh elementov.

Uporaba multispektralnega (z več fluorokromi) načina delovanja laserskega vrstičnega konfokalnega mikroskopa omogoča preučevanje kokolacije (prostorske medsebojne razporeditve) v celici dveh ali več različnih snovi, na primer proteinov, označenih z različnimi fluorescentnimi barvili. Pri pregledu takšnih preparatov v običajnem fluorescenčnem mikroskopu je nemogoče z gotovostjo trditi, ali se te snovi nahajajo ena poleg druge ali ena pod drugo. Z uporabo metode optičnih prerezov in nadaljnje 3D rekonstrukcije objekta je mogoče poustvariti volumetrično porazdelitev snovi. Multispektralni način omogoča tudi študije FISH na konfokalnem mikroskopu.

Metode konfokalne mikroskopije omogočajo ugotavljanje sposobnosti akumulacije snovi v citoplazmi, jedru ali drugih celičnih strukturah, registracijo tvorbe metabolitov, merjenje kinetike akumulacije in presnove snovi v celici, hitrost odstranjevanja snovi iz celice. celico in primerjajte intenzivnost metabolizma v različnih celičnih linijah in pod različnimi pogoji. Te metode se vse pogosteje uporabljajo pri preučevanju mehanizmov delovanja tako rakotvornih snovi kot zdravil in protitumorskih spojin ter omogočajo izračun njihovih učinkovitih koncentracij.

Analiza intenzitete in oblike intrinzičnih fluorescenčnih spektrov omogoča prepoznavanje normalnih in vnetnih celic, zlasti ta metoda je bila predlagana kot nova metoda za zgodnjo diagnostiko materničnega vratu.

Z izbiro kombinacije filtrov za več tipov intrinzične fluorescence je mogoče brez izvajanja histokemičnega barvanja in delovno intenzivnega zajemanja in pregleda več rezov razlikovati med malignimi in normalnimi tkivnimi strukturami v vzorcih biopsije bezgavk bolnikov z limfadenopatijo različnega izvora.

Metode konfokalne mikroskopije se pogosto uporabljajo v embriologiji in hidrobiologiji, botaniki, zoologiji pri preučevanju strukture gamet, razvoja in tvorbe organizmov.

Konfokalna mikroskopija je ena izmed metod optične mikroskopije, ki ima v primerjavi s klasičnimi mikroskopi velik kontrast zaradi uporabe diafragme, ki prekine tok razpršene svetlobe ozadja. V konfokalnem mikroskopu se v vsakem trenutku posname slika ene točke predmeta, s skeniranjem (premikanje vzorca ali preureditev optičnega sistema) pa se sestavi polna slika. Za registracijo svetlobe samo iz ene točke je za lečo objektiva nameščena majhna diafragma, tako da svetloba, ki jo oddaja analizirana točka, prehaja skozi zaslonko in bo registrirana, svetloba iz preostalih točk pa je v glavnem zakasnjena. po diafragmi.

Povečanje kontrasta slike je doseženo tudi zaradi dejstva, da osvetljevalec ne ustvarja enakomerne osvetlitve vidnega polja, ampak fokusira svetlobo na analizirano točko. To lahko dosežemo tako, da za vzorec postavimo drugi sistem za fokusiranje, vendar to zahteva, da je vzorec prozoren. Poleg tega so leče objektivov običajno razmeroma drage, zato uporaba drugega sistema za ostrenje za osvetlitev nima velike koristi. Druga možnost je uporaba razdelilnika žarka, tako da tako vpadno kot odbito svetlobo fokusirata ena leča. Ta shema tudi olajša prilagajanje.

Zmanjšanje luknje v diafragmi vodi do zmanjšanja debeline optične plasti, kar poveča kontrast slike, hkrati pa se zmanjša njena svetlost, kar zahteva uporabo visoko občutljivih snemalnih sistemov in med raziskovalnim procesom , zahteva kompromis med svetlostjo in kontrastom nastale slike.

Najpogostejša naloga konfokalne mikroskopije je zaradi visoke ločljivosti in kontrasta preučevanje strukture celic in njihovih organelov, na primer citoskeleta, ER, lizosomov, mitohondrijev, jedra, kromosomov in celo genov. Proučuje se tudi kolokalizacija dveh ali več snovi v celici. Druga naloga je preučevanje dinamičnih procesov, ki se dogajajo v živih celicah. Na primer celični transport biološko aktivnih spojin, spremembe v koncentraciji in porazdelitvi kalcijevih ionov. S snemanjem serije optičnih rezov v pomnilnik računalnika je mogoče izvesti volumetrično rekonstrukcijo objekta in pridobiti njegovo tridimenzionalno sliko brez uporabe delovno intenzivne tehnike izdelave in fotografiranja serijskih histoloških rezov.

Nova obetavna področja sta tehniki FRAP – Fluorescence Recovery After Photobleaching in FRET – Fluorescence Resonance Energy Transfer.

Glosar:

FRAP se uporablja za preučevanje mobilnosti bioorganskih molekul z začetkom fotokemične razgradnje fluorokroma v območju obsevanja in njegove kasnejše ločitve od molekul. Po zgorevanju se molekule s fluorokromom iz neobsevane cone zaradi difuzije premaknejo v obsevano cono vzorca. Po povečanju fluorescence v njem lahko ocenimo mobilnost molekul.

FRET uporablja se za določanje razdalje med molekulami različnih tipov, njihovim okoljem in interakcijo. Molekule so označene z dvema fluorokromoma, pri čemer se emisijski spekter donorja prekriva z absorpcijskim spektrom akceptorja. Energija se prenaša od donorja do akceptorja na kratke razdalje (nekaj nm) kot posledica resonance med energijskimi ravnmi, njena verjetnost pa je odvisna od razdalje med molekulami. Akceptor nato oddaja energijo v vidnem območju spektra, ki jo posname konfokalni mikroskop.

Dvofotonska (večfotonska) mikroskopija -Dvafoton (večfoton)mikroskopija- Tehnika, ki izhaja iz laserske skenirajoče konfokalne mikroskopije, pri kateri se fluorokromi vzbujajo z laserskim sevanjem v infrardečem ali dolgovalovnem vidnem območju, katerega gostota se podvoji ali celo potroji na točki fokusa na vzorcu. Vzorčne fluoroforje vzbujata dva ali trije dolgovalovni fotoni, kar je enakovredno vzbujanju z enim kratkovalovnim fotonom. Na primer, vzbujanje z dvema ali tremi 900 nm fotoni je enakovredno vzbujanju z enim 450 ali 300 nm fotonom. Večfotonska mikroskopija omogoča globlje prodiranje v tkivo in ne zahteva konfokalne mikrodiafragme, saj se njena fluorescenca pojavlja strogo v goriščni ravnini.

Akustično-optični nastavljivi filter (AOTF) -Acousto-OptičniNastavljivFilter (AOTF)- Filtrirna naprava, ki uporablja zvočne vibracije za modulacijo valovne dolžine ali jakosti svetlobe, ki jo oddaja laser ali nekoherentni vir svetlobe (predvsem obločne svetilke). Filter je sestavljen iz posebnega kristala (telurjevega oksida ali kremena), ki je na obeh straneh vpet z akustičnim oddajnikom in absorberjem za induciranje stoječih akustičnih valov v kristalu s spremenljivimi conami visoke in nizke refrakcije. Če gre polarizirana ali nepolarizirana svetloba skozi filter, deluje kristal nanj kot uklonska rešetka in odklanja presvetli žarek. Za spremembo obdobja uklonske rešetke se izberejo značilne dolžine stoječih valov, ki izhajajo iz sprememb v zvočnih nihanjih, ki se dovajajo kristalu.

Pasovni filter -BandpassFilter- filter, ki prepušča določen obseg (pas) valovnih dolžin, pri tem pa duši valove večjih in krajših dolžin od prepuščenih. Valovno dolžino v sredini oddanega pasu običajno imenujemo povprečje (angleška okrajšava CWL). Efektivna pasovna širina se meri s širino območja, ki prepušča polovico največje vpadne svetlobe, imenovano tudi polovična pasovna širina (okrajšavi FWHM in HBW). V fluorescenčni mikroskopiji se pasovni filtri pogosteje uporabljajo na poti vzbujanja in manj pogosto kot pragovni (pregradni) filtri.

Razdelilnik žarka -Razdelilnik žarkov- Optična naprava, ki se uporablja za razdelitev vpadnega svetlobnega žarka na dve ali več komponent, od katerih je vsaka projicirana v različnih smereh. Razdelilniki žarkov so na voljo v različnih konfiguracijah, ki ustrezajo posebnim pogojem. Okularne enote optičnih mikroskopov uporabljajo prizmatične razdelilnike žarkov za hkratno projiciranje slik v okularje in kamero (digitalni fotoaparat). Za pridobivanje linearno polarizirane svetlobe se uporabljajo polarizacijski cepilniki snopa iz naravnega kremena, materiala z dvojnim lomom. V fluorescenčni mikroskopiji se dikromatska (dihroična) zrcala uporabljajo kot razdelilniki žarkov za odboj vzbujevalnih valov nazaj do vira in prenašanje sekundarnega fluorescenčnega sevanja z daljšo valovno dolžino do okularjev in detektorja.

Hladno ogledalo -hladnoOgledalo- Specializiran dikromatski interferenčni filter, ki odbija celoten vidni spekter v zelo širokem temperaturnem območju, vendar zelo učinkovito prenaša valove v infrardečem območju. Podobno kot vroča ogledala so lahko hladna ogledala zasnovana tako, da odbijajo žarke, ki padajo pod kotom od nič do 45 stopinj, in so sestavljena iz večplastnih dielektričnih prevlek, kot so interferenčni filtri. Hladna zrcala se lahko uporabljajo kot dikromatski cepilniki žarkov v laserskih sistemih za odboj vidne svetlobe in prenos infrardeče svetlobe.

Dihromatski cepilnik žarka (dihroično zrcalo) -DikromatskiRazdelilnik žarkov (Dikroičnaogledalo)- Kombinacija interferenčnega filtra/zrcala, ki se običajno uporablja v kompletih filtrov za fluorescenčno mikroskopijo za ustvarjanje jasno definiranega prehoda med oddanimi in odbitimi valovnimi dolžinami. Dikromatsko zrcalo, nagnjeno pod kotom 45 stopinj glede na vpadno svetlobo in oddano sevanje, odbija kratkovalovno vzbujevalno sevanje pod kotom 90 stopinj na vzorec in prenaša sevanje z daljšo valovno dolžino od vzorca do okularjev in detektorja. Dihromatska zrcala za fluorescenčno mikroskopijo, izdelana iz tankih interferenčnih filmov, lahko odbijejo do 90 % vzbujajočega sevanja, hkrati pa prepuščajo do 90 % pasu fluorescenčnega sevanja. Dihromatska zrcala so običajno osrednji (glavni) element v treh vrstah filtrov (vzbujalna, pregradna in dikromatska zrcala), ki jih najdemo v banki fluorescentnih optičnih filtrov.

Filtrirna rampa -FilterNaklon- Naklon optičnega filtra je značilnost profila filtra v območju prehoda od blokiranja do prenosa. Na splošno je naklon filtra označen z valovno dolžino, pri kateri ima filter določeno prepustnost, in naklonom odziva na tem mestu. Dva različna filtra imata lahko enake mejne frekvence, vendar popolnoma različne mejne vrednosti in padce. Filtri z zelo strmimi nakloni imajo ozko pasovno širino, medtem ko plitvi nakloni pomenijo široko pasovno širino.

Polna širina največ na polovici -PolnPremerpriPolNajveč (FWHM)- Razpon valovnih dolžin, ki jih prenaša stekleni ali interferenčni filter, je opisan s parametrom, znanim kot polna največja polna širina (FWHM). Meje meje so definirane kot najkrajše in največje valovne dolžine, ki jih filter prepušča pri 50 % maksimuma, povprečna valovna dolžina (CWL ali CWL) pa je aritmetično povprečje vseh valovnih dolžin znotraj območja. Na primer, vrednost FWHM 40 pomeni, da je razpon oddane valovne dolžine 40 nm, vrednost CWL pa lahko leži kjerkoli od ultravijoličnega do infrardečega dela spektra. V mnogih besedilih se FWHM lahko imenuje polovična pasovna širina (HBW).

Video kamereALI JE-Ojačevalecsilicij-OjačevalecCilj (ALI JE)Kamera- Video kamere, zasnovane za delovanje pri nizkih svetlobnih ravneh, na primer pri fluorescenčni mikroskopiji vzorcev z zelo nizkim kvantnim izkoristkom. Te kamere običajno vključujejo SIT cev (z nizom diod), dopolnjeno z ojačevalcem slike v kombinaciji z optičnimi vlakni v prvi stopnji ojačanja svetlobe.

Optična mikroskopija bližnjega polja (LSOM)) - blizu-PoljeSkeniranjeOptičnimikroskopija (NSOM)- Slikanje bližnjega polja se pridobi tako, da se submikronska optična sonda (svetlovodnik) postavi izjemno blizu preučevanega predmeta in spusti svetlobo skozi majhno diafragmo na koncu sonde. Bližnje polje razumemo kot območje nad površino preučevanega predmeta, ki je manjše od valovne dolžine vpadne svetlobe. Znotraj bližnjega polja evanescentna svetloba ni omejena z uklonom in je mogoče pridobiti informacije o objektih nanometrskega merila. Ta pojav omogoča pridobivanje slik onkraj uklonske pregrade in izvedbo spektroskopije vzorcev, ki je nedosegljiva z uporabo običajne optične mikroskopije.